将来のバイオテクノロジー専門家の準備

生物学に興味がある場合、特にこのテーマを教えている場合は、食品のDNAに含まれる遺伝的に異質な遺伝子を特定するための実験室での作業の準備と実施に関する私の記事が役に立ちます。



GMOをめぐる論争、および「自然/神の問題」への人間の介入の合法性に関する絶え間ない科学的および倫理的議論は、哲学者に委ねられます。現代の生物学者、生物工学者、生物情報学、遺伝学の専門的能力は、遺伝子を研究し、必要に応じて変更する能力なしには考えられないことを述べているだけです。すでに学校で、そして後に大学で、生物工学の実験と実験は、生徒と学生が明確な課題を設定し、実験の方法論を理解し、データを分析する能力を必要とします。これらすべてが好奇心と自信を育み、科学研究に関連する問題や問題をさらに探求するための基盤を作ります。私の計画-考察BioRad試薬とPCR分析に必要な標準装置を使用して実行された3つのテストに基づいています。ただし、もちろん、GMOの検出には他のキットを使用できます。実験のすべてのニュアンス（プロトコル）は、試薬に付属のドキュメントに詳しく説明されているため、詳細には触れません。：だから、アウトライン計画は2名を運ぶPLANを、それが明確に必要と細かく授業の内容を計画し、されているので- CONSPECT -事前に考える必要があるため、完全に実験の目的を明らかにするために集中する子どもたちと何を教えるべき材料何。

予定

このエクスペリエンスは、2つのセッション用に設計されています。



レッスン1：



1。GMO検出戦略の基本（検出と識別のターゲット）に関する学生の理論的習熟。

2.食品からのDNAの分離（学童または学生は自分が選んだ製品を持ってきます）。

3.ポリメラーゼ連鎖反応を実行します。



2番目のレッスン：

4。ゲル電気泳動とディスカッション。

5.先生からの結論。

概要

最初のレッスン

1.新しい遺伝子と補助要素はどこから来るのか（15〜20分）



遺伝子組み換え生物とは、現代のバイオテクノロジーを使用して得られた遺伝物質の異質な組み合わせを持つ生物です。たとえば、Tiプラスミドを使用すると、外来遺伝子と遺伝子改変植物の特性は、除草剤に対する耐性（cp4、epsps、gox）、害虫に対する耐性（cry）、または製品の品​​質を変える遺伝子（PG、Bay TE）を提供する遺伝子になります。宿主細胞で外来遺伝子を発現させるには、追加の遺伝的要素が必要です。

• プロモーター-転写開始のマーカーとしてRNAポリメラーゼによって認識されるヌクレオチド配列。
• – , - ;
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プラスミドコンストラクトには、フォトシステムIIの高度に保存された葉緑体遺伝子も含まれています。これは、光合成の光反応の一部であり、実行可能なDNAが抽出され、GMの結果が実行不可能なマトリックスに関連付けられていないことを確認します。



図1に示すように、食品中の組換えDNAの同定はいくつかの方法で行うことができます。





図1.食品中の組換えDNAの同定



GMO製品の識別に使用される最も一般的なすぐに使用できる試薬キットは、プロモーターとターミネーターの識別に基づいています。 BioRadのGMOInvestigator Kitは、PCRとDNA電気泳動を使用して、GMOに関連する2つの異なるDNA配列の存在を確認します。カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、Agrobacteriumtumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーターです。これらのDNA配列は、世界中で販売されている遺伝子組み換え植物の85％以上に見られます。ポジティブコントロールのDNAに存在する新しい遺伝子はepspsです。食品から抽出された植物DNAの完全性の制御として、PCRは、ほとんどの高等植物に共通するフォトシステムII葉緑体遺伝子の一部を増幅するために使用されます。したがって、テストは3つのターゲットを対象とします：プロモーター、ターミネーターとフォトシステムIIの葉緑体遺伝子の一部、それぞれ3つのプライマーのセットで、そのうちの2つ（プロモーターとターミネーターのプライマー）が混合されました。したがって、セットには2つのボトルが含まれています。赤-食品にGMOが含まれているかどうかを判断するために使用されるGMOプライマーと、緑-植物材料からDNAが抽出されているかどうかを判断するために使用される植物フォトシステムIIです。



紹介スピーチの後、学生はDNA抽出とPCRのプロトコルに精通し、実験のコースを段階的に説明し、特定のメーカーのKITを使用する機能に焦点を当てる必要があります。



2.食品からのDNAの分離（15〜20分）



利用可能な仕事に応じて、子供たちは2〜3人のグループに分けられ、それぞれが分析のために興味深い食品を選択します。サクサクのグッズを作るほとんどすべてのジャガイモやトウモロコシは外来遺伝子を持っており、それらの中のGMOを非常に簡単に識別できるため、学童にとても愛されているチップやポップコーンは研究資料として歓迎されています。またはベリー、例えば、イチゴ、ブルーベリー、ヒマワリの種のパン。ただし、DNA分離用のKITは特定の製品用に設計されており、たとえばこの場合に使用されるのは、小麦粉、油、調味料、コーンフレークなどからのDNAの分離を意味しないため、誰がどの製品をテストするかを事前に合意することをお勧めします。



私が説明した実験では、DNAはブルーベリー、キュウリ、ヒマワリの種子から分離されました。

この研究の特徴：

1. サンプル（1 g）の事前計量と、乳鉢による徹底的な粉砕。植物のかなり密集した細胞壁（動物細胞にはない）を破壊するには、粉砕が必要です。
2. 塩はすでにInstaGeneに含まれているため、プロテアーゼを添加せずに（細胞タンパク質を破壊する）、塩でDNAを沈殿させることなく、均質化されたInstaGeneマトリックス（もちろん洗剤を使用できます）で分離します。
3. KITには吸着剤が含まれていないため、溶出がなければ、原則として子供はこれに注意を払うことができません。

なぜInstaGeneMatrixが原則として使用されたのですか？これは、DNAを分離するためのかなり高速な方法であるため（15〜20分以内）、授業時間を大幅に節約できます。InstaGeneは、DNAを破壊する酵素（DNaseなど）に必要な2価イオン（Mg2など）もキレートします。



3.ポリメラーゼ連鎖反応の実行



子供が食品からDNAを正常に分離した後、製造元のプロトコルに従って、表1に従って6本のエッペンドルフチューブ用にPCR混合物を調製します（10〜15分）。





リンク



その後、実験の前半は終了します。教師は自分でチューブをアンプに配置し、プロトコルに従って増幅モードを設定します。

2番目のレッスン

4.ゲルの電気泳動とディスカッション（40〜45分）



子供たちはTAEバッファーで3％アガロースゲルを準備します。電気泳動は持続しますが（200 V 20分）、結果の考えられるオプションについて話し合うことができます（図2）。そして、写真を受け取った後、考えられる間違いについて話し合ってください。





図2.考えられるテスト結果

参照



たとえば、きゅうりをテストした子供たちのグループでは、アンプリコンは観察されませんでした（図3）。





図3.サンプル電気泳動（キュウリ）のゲル画像

⁕-コントロール（-GMOを含まない、+ GMOを含む）; T-テストサンプル; M-分子量マーカー; PMM-フォトシステムIIプライマー; GMOはGMOの入門書です。



1つのサンプルの結果に関する議論：この場合、増幅混合物にプライマーは添加されていません。



2番目の経験は、ヒマワリの種子のDNAをテストすることです（図4）。





図4.ヒマワリの種子のサンプルの電気泳動のゲル画像

⁕-コントロール（-はGMOを含まず、+はGMOを含む）。 T-テストサンプル; M-分子量マーカー; PMM-フォトシステムIIプライマー; GMOはGMOの入門書です。



サンプル2の結果に関する議論：ゲノムに修飾遺伝子がなかったネガティブコントロール（ゲルポケット2）にはアンプリコンが含まれていません。これは、プライマーが35SプロモーターとNOSターミネーターのシーケンスサイトを認識しなかったことを示しています。約200塩基対のアンプリコンが検出された反対のパターンが、6番目のゲルポケットで観察されました（陽性対照-遺伝子改変対照）。視覚的には、ポジティブコントロールGMO（ゲルポケット6）では長さ約200 bpの増幅産物が1つしか得られませんでしたが、プロモーターとターミネーターの増幅産物はほぼ同じサイズ（それぞれ、203bpと225bp（BioRad））でした。ゲルポケット6には2つの増幅産物があると仮定できます。ほとんどの研究では、35SプロモーターとNOSターミネーターが最も一般的に使用されており、85％以上のケースで修飾遺伝子を検出するために使用できます。この方法は、上記のプロモーターおよび/またはターミネーターが存在するかどうかの質問に答えるのに十分ですが、この方法は、どの遺伝子が挿入されたかに答えるのに十分ではありません。



フォトシステムII葉緑体遺伝子に特異的なアンプリコンは、修飾遺伝子を含むものと含まないものの両方の3つの食品サンプルすべて（ポケット1、3、5）に見られます。テストサンプルには、NOSターミネーターまたは35Sプロモーターのアンプリコンは含まれていません（ポケット4）。実験は成功し、生徒たちは明確な結果を得たにもかかわらず、写真は曇っているようにはっきりしていません。この現象はゲル全体に広がっているため、1xTAEバッファーの調製中に汚染が発生したと結論付けることができます。それはおそらく実験室で汚染されたガラス製品でした。



最新の経験はブルーベリーのテストです（図5）。





図5.ブルーベリーサンプルのゲル画像電気泳動

⁕-コントロール（-にはGMOが含まれず、+にはGMOが含まれます）; T-テストサンプル; M-分子量マーカー; PMM-フォトシステムIIプライマー; GMOはGMOの入門書です。



3つのサンプルの結果に関する議論：ゲルを実行した後、アガロースゲルを上から下に見ます。 3つの食品サンプルすべてに、フォトシステムII葉緑体遺伝子に特徴的なアンプリコンが含まれています。ネガティブコントロール（GMOプライマーを使用）に縞模様が見られます。これは遺伝的に自由なコントロールであるため、これは非常に奇妙です。約200ベースペアのアンプリコンは予想されませんでした。 200bpのバンドテストサンプル（ブルーベリー）とポジティブコントロールにも表示されます。これは、プライマーがNOSターミネーターの35Sプロモーターの配列決定部位を認識したことを示しています。



しかし、ブルーベリーのサンプルのテストが陽性（遺伝子改変）であることが判明した理由は、ブルーベリーが天然のトランスジェニック植物種であるという事実によるものかもしれません。

研究中のサンプルは、おそらく土壌細菌（tumefaciens）を使用したある生物と別の生物の干渉の例です。ブルーベリーにおける自然なトランスジェニック転移のそのような例の1つは、サンクトペテルブルク州立大学生物学部の遺伝学および生物工学研究所の教授である生物科学博士のTatyanaMatveevaによってすでに特定されています。研究所の彼女と彼女の同僚は、すでに配列決定されたゲノムを持つ植物の世界的なカタログを編集しました。研究された275の植物種のうち、23は天然の導入遺伝子でした。ピーナッツ栽培、クルミ栽培、ホップ、トロピカルグアバフルーツ、クローブフラワー、スリナメチェリー、クランベリー、ブルーベリーが含まれます。 （Matveeva、2019）。



したがって、研究されたブルーベリーは天然の導入遺伝子であるという仮定があります。



5. 2



PCRの実行は簡単なようですが、目的のアンプリコンが得られない場合、または非特異的なフラグメントが発生する場合、トラブルシューティングはより困難になる可能性があります。ほとんどの場合、私たちは実験室で汚染されたガラス製品について話します。試薬の汚染やPCRアプローチを回避するために、各ピペッティングプロセスに新しいピペットチップを使用するように注意する必要があります。さらに、作業中に手袋を頻繁に交換することは理にかなっています。さらに、新しい滅菌済みの反応容器と溶液を常に使用する必要があり、汚染を明確に追跡するために適切にラベルを付ける必要があります。 PCRが機能しない理由はたくさんあります。 PCRを成功させるには、さまざまな化学的および物理的パラメータを観察する必要があります。残念ながら、PCRの後で望ましい結果を得ることができないことが非常に頻繁に起こります。



少量のDNAでもPCRで検出できるため、PCR反応混合物が以前の実験のPCR生成物や他のソースの「外来DNA」で汚染されないようにすることが非常に重要です。

結果

食品中のGMOを検出した経験は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための実践的なスキルを習得することを目的としています。 2つのレッスンのために設計された概要計画が提案されているという事実にもかかわらず、その間の休憩は少なくとも1日ですが、典​​型的なシナリオは教師の裁量にとどまります。この研究の分析セクションは、旅のすべての段階での手順とデータ分析に関連する概念を発見して理解するプロセスを通じて学習者をガイドするように設計されています。このアプローチ（教師が学生にすべての背景情報を提供するのと比較して）が、より多くの学生にとって研究全体をより理解しやすくすることが期待されています。教師が各グループの進捗状況と理解度を確認する機会がある限り（2レッスン中）、必要に応じて、ある程度の独立性が可能です。このアプローチにより、より多くの学習者が上記で定義された目的のスキルを習得できます。



使用済み文献のリスト：

1. bio-rad、「www.bio-rad.com」、2020年2月3日。[オンライン]
2. Matveeva T.、Ottem L.（2019）アグロバクテリウムによる植物の自然な遺伝的形質転換の広範囲にわたる発生。植物分子生物学、101、415-437。DOI：10.1007 / s11103-019-00913-y