量子ナノ温度計：長さ1mmの線虫の温度を測定する

温度は、生物系の状態の主要な指標の1つです。人が感染症を発症すると、体温が上昇します（通常、常にではありません）。これは、脅威に対する免疫系の反応の兆候です。言い換えれば、温度は体のおおよその状態を決定するために使用することができます。問題は、人が（文字通り）大きいことですが、たとえば、線虫の長さは約1mmです。このような小さな生物の温度を測定することは非常に困難でしたが、大阪大学（日本）の科学者はこの問題を解決するための方法論を開発しました。ナノサーモメーターを実装するためにどのような手段が使用され、どのような実際の実験が示され、この開発はどこで使用できますか？これらの質問に対する答えは、科学者のレポートにあります。行く。

研究基盤

生体の体温は、内的・外的要因の影響の程度によって異なります。私たちは周囲の温度が冷血な人々の温度に直接影響するという事実に慣れているため、その値はうらやましいほど規則的に変化します。しかし、通常の生理学的条件下の温血動物でも、温度変動が観察され、これは恒常的な温度調節およびエネルギー代謝に関連している可能性があります。



言い換えれば、ここでの冗談は素晴らしいです：「私はいじり回していません、私は細胞レベルで非常に忙しい人です。」サブミクロンスケールで温度とそのダイナミクスを正確に測定することにより、細胞および分子の活動に関する多くの情報を得ることができます。問題は、測定対象が減少するにつれて、その行為の複雑さが増すことです（薬局から線虫に通常の温度計を入れることは困難です）。



研究の著者は、従来の電気温度計はサブミクロンの分解能を持たず、近赤外サーモグラフィーは通常、生体サンプルの表面温度を決定するのに役立ちますが、内部温度を決定するのには役立ちません。



もちろん、この制限を克服できる発光ナノ温度計（たとえば、感熱性分子プローブ）はすでに存在します。しかし、この手法には欠点もあります。主なものは、長期的な安定性、またはむしろその欠如です。このようなデバイスでは、長時間（たとえば数時間）かかる温度変化を正確に測定できません。そのような温度計からのサンプルへの毒性効果は言うまでもありません。



この作業では、科学者は、ナノダイヤモンド（ナノダイヤモンドからND ）量子温度計の概念について説明します。これは、非常に正確で、堅牢で、毒性が低いものです。その動作の原理は次のとおりです。センサーは、光学的に検出可能な磁気共鳴の周波数シフトとして温度を読み取ります（ODMR光学的に検出された磁気共鳴から欠陥窒素空孔の中心（NVの）窒素-空孔主として格子の熱膨張に起因して生じます）。 NVセンサーコアはダイヤモンド格子に深く埋め込まれており、さまざまな生物学的環境要因の影響を受けません。この量子センサーをより複雑な生物に導入することで、特定の場所での熱活動をリアルタイムで読み取ることができます。しかし、そのような手法を実装するプロセスには、多くの困難が伴います。





Caenorhabditis elegans種の線虫（回虫）。Caenorhabditiselegans



ワームなどの多細胞モデル生物、ミリメートルサイズのボディを収容できる特別なチャンバーが必要であり、サンプル自体を迅速に分析して生理学的状態を維持する必要があります。 Quantum ND温度計は、体が脱水されている場合でも、培養細胞よりもはるかに速く移動するため、高速の粒子追跡アルゴリズムが必要です。さらに、NDの位置の動きと体の複雑な構造により、検出される蛍光強度に大きな変動が生じ、温度測定のアーティファクトが発生する可能性があります。研究のこの段階でのこれらの問題の解決策は、分析されたサンプルの個々の特性へのデバイスの適応に関連しています。将来のナノサーモメーターの設定の多様性と容易さの問題は、将来の作業で検討される予定です。その間、コンセプト自体と仕事の基本原則に注意が払われました。





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ナノサーモメーターの基本は、マイクロ波照射ユニット（1A）を備えた共焦点蛍光顕微鏡です。





画像＃1



スピン励起は、励起状態から基底状態への非蛍光緩和経路を活性化するため、スピン共鳴マイクロ波励起が適用されたときのレーザー誘起蛍光の強度の減少として、窒素空孔のODMRを測定できます（1B）。



サンプルチャンバーはアンテナに組み込まれた使い捨てのガラス底皿で、幹細胞などのデリケートなサンプルに適した大きな光学的アクセス（直径12mm）と使いやすさ（1C）を提供します。ワームの捕獲からの時間Caenorhabditis elegansは、実際の測定のわずか15分前です。これは、ワームの存続に役立ち、ワームの状態に関するより多くのデータを提供します。



さらに、このシステムは、高速粒子追跡とNVセンターオフセットODMRからの高精度のリアルタイム温度推定を効果的に統合します。



粒子追跡では、システムは顕微鏡のxyz軸に沿ってND蛍光強度を測定し、4秒ごとに対応する最大蛍光に焦点を合わせます（追跡間隔を短くすることができます）。その間、温度は0.5〜1.0秒のサンプリング時間で推定されます。 （2A）。





画像No.2



量子温度測定にはいくつかの方法がありますが、この作業では4点測定の方法ODMRを使用しました。この方法では、選択した4つの周波数すべてで検出された光子の数が、検出された蛍光強度の変化に応じて線形にスケーリングされることを前提としています。



ただし、後続の各光子は約0.5％の光感度の違いを示し、特に低光子モードでは、周波数シフト（つまり、数℃に対応する約300 kHz）の推定に重大なアーティファクトが実際に発生することがわかりました。



これらのアーティファクトは、ODMRスペクトルの光パワーに依存する非対称性が原因である可能性が最も高いです。複雑な光学動的システム（つまり、生物学的システム）の温度を正確に測定するには、そのようなアーティファクトを取り除く必要があります。そのため、4点測定方式に誤差補正フィルタを追加しました。



システムの動作を評価するために、エラー修正と組み合わせて、温度NDのリアルタイム測定が段階的な熱イベント中に実行されました。温度の急激な変化は、焦点の大きな焦点ぼけとそれに伴う蛍光強度の変動を引き起こすため、温度の急激な変化は使用できませんでした。



で2Bは光子の総数の時間プロファイルを示す（Iの_TOT）と温度推定ND（ΔT _NV）試料温度（T _Sは）約2.8の工程°と°°→30.4°→44.3 44.3から変化します。正確ΔT出力システム_NV、Tに対応する_Sフォーカス位置は、特に30μm以下（の距離にわたってz軸に沿って、著しく移動したが、図2C）。



3°ステップでは、z軸の6μmの位置シフトが3〜4分以内に現れますが、追跡速度は、105 nm / sのダイナミクスを96分間（2C）追跡するのに十分な速度です。



また、ΔT _NVは明確Iでanticorrelationを示し_TOT..。このタイプの温度依存性の統計的研究により、SDの平均値が決定されます：I _tot ^-1 dI _tot / dT = -3.9±0.7％/°およびdD / dT = -65.4±5.5kHz /°（2D）。温度測定精度はそれぞれ±0.29°と<0.6°Cで、1.8°C /√Hzの感度が得られます。



開発フェーズの一環として、信頼性が高く正確なリアルタイム温度測定を実現した後、生きているワームに対してローカル温度モニタリングのテストを実施しました。





画像№3



写真3Aは、マイクロ波アンテナの近くに配置された、内部のND麻酔ワームを示しています。これらのNDは、ポリグリセリン（PGポリグリセリン）およびマイクロインジェクションによってゴナド（実験ワームのゴナド）に導入されます。



グラフ3Bは、単一のNDのODMRスペクトルを示しています（3Aに矢印でマークされています）。図３Ｃは、温度Ｔ_Ｓが変化するときの１時間にわたるＩ_ｔｏｔおよびΔＴ_ＮＶの時間プロファイルを示している。 まず、T _objを33.2°Cで測定し、6分後に25.3°Cまで下げました。その結果、Tobjは35.2分で28.6°に達しました。 ∆T _NVは、33.2°Cと28.6°Cの2つの静止状態間で正確な温度変化を示しました。







これら二つの定常状態の間ワーム内部の温度の実際のダイナミクスの表示が原因ΔTという事実に表示されている_NVは常にT遅れている_Sによる顕微鏡対物レンズと環境の有限熱容量にやや過小評価の応答を示していると。 Iは_TOTも温度による蛍光強度の漸進的変化を示します。



粒子追跡も満足のいくものでした（3C）。 0〜15分以内に、カウントされたフォトンは、約400 nmで数秒間のNDの位置変動により、頻繁にバーストを示します。



試験結果は、ナノスケールの生体系内の温度測定がリアルタイムで高精度であることを明確に示しています。さらに、追加の試験を実施することが決定され、その前に、実験用ワームは、C ₁₀ H ₅ F ₃ N ₄ O（カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾンからのFCCP）による薬理学的処理を受け、不動の熱発生（大まかに言えば、上昇による温度の上昇）を引き起こした。代謝および追加の筋肉活動なし）。





画像№4



写真4AはFCCPによって刺激されたNDワームを示しています。そして、プロット図4Bは、 ΔTの時間プロファイルを示す_NVを写真の矢印でマークされたND。



測定開始から7分後、FCCPソリューションを使用しました。 32分で、ΔT _NVは徐々に増加し始め、48分で、さらに大きな付加的な増加は、温度変化のレベルが4から7まで上昇したときに観察され℃で熱は約80分続きました。



刺激中、NDは1時間かけて数マイクロメートルゆっくりと移動します。これは、NDが顕微鏡下で継続的に観察された個別の実験の結果を裏付けています。



ワームの対照群（図4Cおよび4D FCCPを注入しなかった）、均一なΔTを示した_NVの応答を、任意の明白な温度変化なしに試験を通して。



FCCPが実際にワームの体温の上昇を誘発することをさらに確認するために、ND標識ワームの定量化を対照群と治療群の両方で実施しました（4E）。グラフは、対照群と比較した実験群のワームの温度上昇を明確に示しています。



別の対照実験は、ここでないバッファを添加しなかったとΔT _NVをしたドーパントの添加はΔT引き起こすこと、静的番組を監視_NVをするが変動による温度変化やODMRシフトアーチファクトによるいずれか、一定のレベルで。ただし、FCCPを追加すると、このようなシフトを観察することはできません。これにより、実験グループのワーム（4F）でFCCPによる温度の上昇がさらに確認されます。）。



研究のニュアンスについてのより詳細な知識については、科学者の報告とそれに追加された資料を調べることをお勧めします。

エピローグ

この研究では、科学者は、ナノスケールの生物学的システム内の温度をリアルタイムで正確に測定できる技術を開発することができました。誇張して言えば、彼らはなんとか長さ約1mmのワームCaenorhabditiselegansの体温を測定することができました。



小さなサンプルよりも大きなサンプルの方がはるかに簡単に測定できることを理解することが重要です。それにもかかわらず、ワームの体内に注入されたナノダイヤモンドの使用は、通常の条件下でのワームの体温を知ることを可能にしました。これらのナノダイヤモンドは、体内に入り、急速に動き始めます。特別に開発されたアルゴリズムと共焦点蛍光顕微鏡により、それらの動きを追跡および分析することが可能になりました。得られたデータにより、温度上昇の原因となる特殊物質を導入した後でも、ワームの体温とそのダイナミクスを正確に測定することができました。



この作品は、量子技術が生物学に適用できること、そして適用されるべきであることを示しているだけでなく、マクロレベルでさまざまなプロセスを診断するという側面で可能性の範囲を広げています。多くの場合、生物学的システムの状態は、細胞内で発生するプロセスに直接または間接的に依存します。これは、以前はリアルタイムで測定することが非常に困難でした。システムの構成要素に関するより多くの情報を受け取ると、システム自体をよりよく理解できるようになります。これにより、もちろん、システムの運用により効果的に影響を与えることができます。



ご清聴ありがとうございました。好奇心を持ち、素晴らしい週末をお過ごしください。:)

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