光合成細菌からのスパイダーシルク

私たちが長い間知っているように、自然は多くの研究、発見、実験のための優れたインスピレーションの源です。鳥や翼のある昆虫は、空がかなり達成可能であることを示し、水生哺乳類は、水中での滞在を延長する方法を示し、スパイダーは、小さな生き物でも信じられないほどの何かを作り出すことができることを証明しました。今日検討している研究では、物理化学研究所（和光、日本）の科学者が、光合成細菌を使用して人工ウェブを作成する方法を発見しました。彼らはこれをどの程度正確に達成し、結果として生じるクモの巣はどれほど自然であり、なぜ光合成細菌が使用されたのですか？これらの質問や他の質問への回答は、科学者の報告で私たちを待っています。行く。

研究の基礎

多くの人にとって、クモは「ああ、彼を私から降ろして！」です。または「うーん、なんて嫌なんだ」。しかし、これらの生き物に対する嫌悪感と偏見を別にすれば、これらの8本足の捕食者がどれほどユニークであるかを考えることができます。スパイダーの解剖学は文字通り完璧な狩りのために作られています。一方では、獲物や敵を麻痺させたり、殺したりする可能性のある毒があります。一方、感覚器官は発達している（特に全身の毛状突起（毛）による触覚）。多くの比喩やキャッチフレーズの基礎となっているクモの訪問カードは、彼らのウェブです。





スパイダーが有名なウェブを作成する方法についてのビデオ。



ウェブの核となるのはタンパク質であり、その組成はグリシン（C ₂ H ₅ NO ₂）、アラニン（NH ₂ -CH（CH ₃）-COOH）、セリン（HO ₂ C-CH（NH ₂）CH ₂ OH ）に富んでいます。）。蜘蛛の巣は特殊な腺で形成され、液体の形になっています。



腺の分泌物が多数の回転管を通して放出されると、特別なクモの疣贅がそこから糸を形成し、クモはそれを使用して致命的なトラップを構築します。



スパイダーウェブスレッドは、その機械的特性が他の多くの材料よりも優れているため、独特です。たとえば、通常のスパイダー（Araneus diadematus）のスパイダーウェブの引張強度は1.1〜2.7 GPa、人間の髪の毛の場合は0.25 GPa、鋼の場合は0.4〜1.5GPaです。スパイダーシルクの密度は鋼の1/6（1.3 g / cm ³）です。つまり、ウェブを持って地球を一周すると、その重量はわずか500グラムになります。 108×約1.2 J / Mのエネルギー密度³..。また、スパイダーシルクは非常に柔軟性があります。元の長さの最大5倍（リラックスした状態）まで、途切れることなく伸ばすことができます。スパイダーウェブの衝撃強度は、ポリアラミド糸に匹敵します。スパイダーは極限性ではありませんが、そのウェブは-40°Cから220°Cの温度に簡単に耐えることができます。さらに、シルクの生分解性と生体適合性により、医療用途に適しています。





スチールスレッドとスパイダーシルクの引張強度の比較（対応する密度）。



また、あるタイプのスパイダーが、特性と用途が異なるいくつかのタイプのウェブを生成できることも不思議です（Argiope argentata種のスパイダーは、ウェブの5つのバリアントを生成します）。

• 外縁とウェブフレーム用（非常に耐久性があります）;
• 獲物捕獲の領域（非常に粘着性があり、弾力性があり、耐久性があります）;
• ( );
• ( 2 3 );
• ;
• .

これはスパイダーシルクの簡単な説明ですが、それでもこの物質の独自性を理解するには十分です。そのため、多くの科学者が長い間、ウェブに相当する人工的なものを作成しようと試みてきました。多くの人にとって、これは非常に成功しています。しかし、大量生産の問題は未解決のままです。



私たちが今日検討している研究では、科学者たちはこの問題の解決策を提案しています。それは紫の細菌使用することにあるRhodovulum sulfidophilumの両方の性質を有する、phototrophs *および好塩菌を*。

フォトトロフ*は、光を使用してエネルギーを生成する生物です。

好塩性*は、高塩分条件で生活する極限性の一種です。

R.sulfidophilumは、生物水素、生物可塑性物質、細胞外核酸を生成するさまざまな代謝特性を備えた海洋性無酸素光合成*細菌です。

無酸素光合成* -従来の光合成とは異なり、無酸素光合成中に分子状酸素は形成されません。

しかし、科学者にとってR.sulfidophilumの最も重要なスキルは、光合成と固定のプロセスを通じて、光（エネルギー）、CO ₂（炭素源）、N ₂（窒素源）などの安価で再生可能な資源を使用して、光合成独立栄養条件で成長する能力です。窒素。さらに、R.sulfidophilumは海水中で繁殖し、栽培中の生物学的汚染のリスクを減らすのに役立ちます。



近年、組換え宿主生物（Escherichia coliバクテリア、Pichia pastoris酵母、シルクワーム）を用いたスピドロイン（MaSp、スパイダーシルクタンパク質）の大量生産で良好な結果が得られています。Bombyx mori、タバコ、哺乳類細胞培養など）。



この作品の作者は前任者の成功を否定していませんが、生産量が非常に少なく、生産自体のコストが高いために最終製品のコストがかなり高いことに注意してください（微生物発酵の場合、生産コストの70％は原材料です）。



彼らの研究では、著者らは、光ヘテロ栄養または光独立栄養成長の条件下で少量の有機物を使用して疎水性反復配列MaSp1（スピドロイン-1）を生成できる細菌R.sulfidophilumを使用してスパイダーシルクを経済的かつ効率的に製造するための新しい方法を提案しています。

研究成果

まず、細菌R.sulfidophilumを準備する必要がありました。



外因性プラスミドDNAを導入する可能性R.sulfidophilum細菌によって*共役pCF1010から得られたプラスミドを用いて大腸菌ドナー株としてS17-1をしている、以前に報告されて。

コンジュゲーション* -2つの細菌細​​胞の直接接触中の遺伝物質の一部の一方向の移動。

この研究では、カナマイシン耐性遺伝子、特定のヌクレアーゼをコードするmob遺伝子、および転移源（oriT *）を含む別のベクター（pBBR1MCS-2）を使用することにしました。これらは、グラム陰性細菌抱合で広く使用されていました。

oriT *は、細菌結合中に細菌宿主からレシピエントにそれを含むDNAを転送するために必要な短い配列（最大500 bp）です。

R.sulfidophilumの染色体（アクセッション番号NZ_CP015418）では、TerBファミリーのテルライト耐性タンパク質をコードする2つのテルライト耐性遺伝子がA6W98_RS06280およびA6W98_RS17070遺伝子座に存在していました。



カナマイシンおよびテルライトに対する耐性の特徴は、R。sulfidophilumの陽性抱合体を選択するためのマーカーとして使用されました。



プラスミド* pBBR1-Ptrc-MaSp1に含まれるもの：

• * trcプロモーター（Ptrc）。これはE.coliの強力なハイブリッド構成プロモーターです。
• リボソーム結合領域（RBS）の配列「AGGAGA」。
• MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).

* — , .

* — , - ( ).

湿った細胞塊の約0.4グラム（CWMから細胞湿潤質量）組換えを50mlから得られたR.のsulfidophilumの培養即ち海ブロス（からMBから、光合成従属栄養性条件下で定常増殖に成長マリンブロスにおけるLED照明付き）（730 nm、20-30 W / m ²）4日間。





画像＃1ポリアクリルアミドゲル電気泳動/ SDSPAGE（1c）を使用して



、R。sulfidophilumのすべての組換え培養物で組換えMaSp1タンパク質の過剰発現が明確に検出されなかったという事実にもかかわらず）、MaSp1タンパク質の陽性発現は、pBBR1-Ptrc-MaSp1-（1-mer、2-mer、3-mer、または6-mer）を運ぶすべての作成された組換えR.sulfidophilum細胞のタンパク質イムノブロッティングによって確認されました（1d）。

K-メジャー* -生物学的シーケンスに含まれる長さkのサブシーケンス。

得られたコンストラクトの唯一のリピートドメインには、次の形式の33個のアミノ酸残基が含まれています：



NH ₂ -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH。



N末端の非シドロイン配列（His-Tag、S-Tag、エンテロキナーゼ、トロンビンの切断領域）を含む標的タンパク質の理論分子量は、1-mer（81 aa）で7.9kDaです。2マーの場合は10.5kDa（114 aa）; 3マー（147 aa）の場合は13.1 kDa、6マー（246 aa）の場合は20.9kDa。

はい-原子質量単位の指定。kDa-キロダルトン（1 kDa = 103 Da）。



優勢な対立遺伝子は大文字で示されます（A対a）。各親が1つの対立遺伝子を提供するため、AA、Aa、およびaaの組み合わせが可能です。

MaSp1タンパク質の発現を確認することに加えて、R.sulfidophilumの組換え培養から得られたMaSp1タンパク質の量も評価されました：〜3-10 mg / L（1-mer = 3.4 mg / L; 2-mer = 3.9 mg / L ; 3-mer = 10.2 mg / l; 6-mer = 6.8 mg / l）またはタンパク質の総量の3.5〜6.9％。比較のために、E。coliのよく知られていて広く使用されている組換えシステムでのスピドロインの異種発現は、約0.3〜1.2 mg / Lの精製スピドロインしか生成できません。



科学者によると、この研究で最も驚くべき結果は、海洋光合成生物に基づく微生物細胞工場の実証であり、再生可能な非食品原料と海水を培養媒体として使用して、光合成独立栄養成長レジームを適用することができます。



pBBR1 -Ptrc-MaSp1-（6-mer）を運ぶR.sulfidophilumは、重炭酸塩（1）でLED（730 nm、20-30 W / m ²）に照らされたときに、人工海水（人工海水からのDaigo ASW）で培養されました。g / l）無機炭素源として、窒素ガス（0.5 l / d）を窒素源として。培養時間は7日（2a）でした。





画像No.2



MaSp1の分子量が大きいほど、クモの絹繊維の引張強度が高くなるため、最大の構成単​​位であるMaSp1-（6-mer）が後続の実験に選択されました。重炭酸ナトリウムは、炭酸塩がより高い溶解性およびCOより低い輸送コスト持っているので、無機炭素を供給するために使用されている₂ガス。



以前の研究者は、細胞R.sulfidophilumの成長に必要な照明条件を決定するための実験を実施しました：強度（8および50 W / m ²）および波長（730、800および850 nm）。この研究では、組換えR.sulfidophilumの成長効果を評価しましたASW培地が不足しているいくつかの追加の栄養素（酵母抽出物、ビタミン、鉄、リン）。



乾燥細胞量（CDM）は、0.90 g / L（すべての栄養素を含む）から酵母抽出物の非存在下では0.66 g / Lに、リンの非存在下では0.39 g / Lに減少しました。組換えR.sulfidophilumは、NaHCO ₃、N ₂ガス、またはリン（2b ; ASW + N ₂、ASW + C + N ₂、ASW + C + P、およびASW + P）なしではASWで成長できないことも確認されています。+ N ₂）。



このようなASW培地バリアントのCDM（〜0.4 g / L）は、おそらく接種剤に由来します*または、サンプルを2％塩化ナトリウムで洗浄した後でも接種します。したがって、炭素、窒素、およびリンの供給源は、ASW培地での組換えR.sulfidophilumの成長に必要です。

微生物接種剤* -植物に有用な微生物の生きた培養物を含む生物学的製品。

予想通り、細胞増殖は0.34±0.02 g / L（ASW + C + N ₂）から0.58±0.08 g / L（1.7倍の増加）および0.81±0.02 g / L（2.4倍の増加）に大幅に増加しました。それぞれ、酵母抽出物（ASW + C + N ₂ + YE）およびリン（ASW + C + N ₂ + P）の存在下。



最高のCDMは、酵母抽出物とリンを添加することで達成され、1.04±0.06 g / L（3.1倍の増加）が得られました。



ASW + N ₂、ASW + C + N ₂、ASW + C + PおよびASW + P + N ₂（2cおよび2d）の条件下で、約0.2 mg / Lの組換えタンパク質MaSp1（タンパク質の総量の2％）の収量が観察されました。）。 MaSp1タンパク質の生成は、酵母抽出物の添加によって促進され、MaSp1タンパク質の収量が0.12±0.10 mg / L（ASW + C + N ₂）から3.93±2.76 mg / L（ASW + C + YE + N ₂）に大幅に増加しました。



酵母の添加により、総タンパク質中のMaSp1の割合も1.2±1.0から6.9±5.3％に増加しました。不思議なことに、リンの添加はCDMの増加にプラスの影響を与えましたが、MaSp1タンパク質の生成にマイナスの影響を与えました。



ASW + C + YE + Nに比べて₂ ASW + C + YE + P + Nで₂媒体、MASP1タンパク質の収量は2.71±1.09 mg / Lでに減少し、総タンパク質中MASP1の割合は3.9±1.6％に減少しました。



培養液によるタンパク質産生のこれらの違いの説明は、各成分の機能性にあるかもしれません。たとえば、酵母抽出物は主にタンパク質の生合成を促進する窒素源です。一方、リンは多くの重要な細胞化合物の重要な主要栄養素およびヘテロ元素であり、一次生産者の成長を促進します。



スパイダーシルクを通常の形にするには、MaSp1を精製する必要がありました。





画像＃3



繊維の押し出しに十分なMaSp1タンパク質を得るために、発酵（3a）を実行してMaSp1-（6-mer）を生成しました。



一般に、スピドロインのサイズは、特定の分子量に対する引張強度と正の相関があります。タンパク質が大きいほど、鎖間および鎖内の相互作用が多くなり、絡み合いが多くなり、鎖の終わりの欠陥が少なくなります。



MaSp1-（6-mer）の精製は、MaSp1遺伝子カセットのN末端に存在するヒスチジンタグを介したアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを使用して行いました。その結果、約40gのCWMから約10mgの精製MaSp1-（6-mer）（3b）が得られました。



シルクファイバーは、ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）に溶解した10 wt％の精製MaSp1-（6メジャー）を凝固浴にピペッティングした後、鉗子（3c）で手動で引っ張ることによって調製しました。）。凝固浴として90％の2-プロパノールを使用すると最良の結果が得られ、比較的穏やかな脱水が行われ、効率的な糸引きが可能になりました。走査型電子顕微鏡による分析では、繊維の直径は10〜20 µmで、表面は繊維の軸に平行な溝で覆われていることがわかりました。フラクトグラフィーは、内部構造がミクロフィブリル（3dおよび3e）で構成されていることを示しました。



研究のニュアンスについてのより詳細な知識については、科学者の報告とそれに追加された資料を調べることをお勧めします。

エピローグ

この作品では、科学者たちは、MaSp1タンパク質の生産のためのマイクロファクトリーの成功した作成について話しました。この生産の主なリーダーは細菌R.sulfidophilumであり、そのおかげで、光合成独立栄養成長の条件下で人工スパイダーウェブタンパク質の光ヘテロ栄養発現を達成することができました。



言い換えれば、科学者は細菌を遺伝子改変してスパイダーシルク、より具体的にはその重要な成分であるタンパク質MaSp1を生成しました。遺伝子操作に加えて、細菌の培養に最適な条件を確立することも必要でした。結局のところ、理想的な環境は人工海水です。さらに、栄養源として窒素ガスと酵母抽出物を使用する必要がありました。一緒に、これらの成分は効率的な細菌の成長、したがってクモの巣タンパク質の生産につながります。



タンパク質から得られたクモの巣の繊維は、ネフィラ種のクモによって生成された天然のものと構造が非常に類似していることも重要です。



科学者たちは、スパイダーシルクタンパク質を成長させる彼らの方法は、他の物質を成長させるためにも使用できることに注意しています。将来的には、研究の著者は、タンパク質生産の量を増やし、結果として得られる製品の分子特性を改善するために、マイクロファクトリーを改善することを計画しています。



科学者によると、彼らの仕事は多くの問題の解決に貢献することができます：エネルギー、水と食物の危機、固形廃棄物の問題、地球温暖化など。この幅広い可能性の理由は、これらの工場が炭素中性プロセスを使用して生分解性および生体適合性の材料を製造しているという事実です。



ご清聴ありがとうございました。好奇心を持ち、良い一週間をお過ごしください。:)

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